導(dǎo)讀：最近，加州大學(xué)圣地亞哥醫(yī)學(xué)院細(xì)胞和分子醫(yī)學(xué)系教授Steven F. Dowdy博士帶領(lǐng)的研究小組，在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊《Nucl Acids Res》發(fā)表一項(xiàng)研究，開(kāi)發(fā)出一種高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重組方法，通過(guò)將表型突變加選擇性siRNA位點(diǎn)同時(shí)引入一個(gè)基因的一個(gè)等位基因中，來(lái)研究哺乳動(dòng)物的基因功能。 
      
      加州大學(xué)圣地亞哥醫(yī)學(xué)院細(xì)胞和分子醫(yī)學(xué)系教授Steven F. Dowdy博士長(zhǎng)期以來(lái)從事細(xì)胞周期和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域的研究工作。最近，他帶領(lǐng)的課題組先后在多家國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊發(fā)表重要研究成果。生物通 www.ebiotrade.com

      在2014年7月份，該課題組在《eLife》發(fā)表的一篇論文中表示，他們發(fā)現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程中起至關(guān)重要作用的一種蛋白并非以往認(rèn)為的、導(dǎo)致一個(gè)重要的腫瘤抑制因子失活，而是激活了它。這一研究發(fā)現(xiàn)是該研究小組差不多20年研究工作的結(jié)果，它完全顛覆了原來(lái)所認(rèn)為的：在癌癥中一種叫做p16-cyclin D的最常見(jiàn)遺傳信號(hào)通路突變驅(qū)動(dòng)了所有癌細(xì)胞中細(xì)胞周期進(jìn)程的一個(gè)基本方面。相關(guān)閱讀：20年研究顛覆癌癥教條。接著在11月份，該小組在Nature旗下子刊《Nature Biotechnology》發(fā)表了他們所開(kāi)發(fā)的一種新技術(shù)：采用化學(xué)方法來(lái)偽裝RNAi藥物，使得它們能夠進(jìn)入到細(xì)胞中。一旦進(jìn)入，細(xì)胞機(jī)器會(huì)將這些偽裝的藥物前體siRNNs轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚訰NAi藥物。

      新年伊始，該課題組又在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊《Nucl Acids Res》發(fā)表題為“Efficient CRISPR-rAAV engineering of endogenous genes to study protein function by allele-specific RNAi”的論文。在這項(xiàng)研究中，研究人員開(kāi)發(fā)出一種高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重組方法，通過(guò)將表型突變加選擇性siRNA位點(diǎn)同時(shí)引入一個(gè)基因的一個(gè)等位基因中，來(lái)研究哺乳動(dòng)物的基因功能，可允許在同一細(xì)胞中進(jìn)行野生型和突變型蛋白的表達(dá)。

      研究哺乳動(dòng)物基因功能的經(jīng)典方法是，用遺傳學(xué)手段敲除基因或用RNAi刪除mRNA，從而去除感興趣的蛋白，來(lái)誘導(dǎo)一種表型。為了確認(rèn)所靶定的基因是否為誘變基因，我們需要修復(fù)相同基因一個(gè)變異體的異位表達(dá)所引起的功能表型缺失。遺憾的是，組成型基因敲除可激活一種顯著損害表型和基因功能的代償機(jī)制。

      相反，急性RNAi介導(dǎo)的基因缺失可以揭示更多的功能，并帶來(lái)一個(gè)更為詳細(xì)的分子機(jī)制。然而，修復(fù)基因缺失或損耗，同樣充滿了潛在危險(xiǎn)。通常使用蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)——包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下面穩(wěn)定的整合基因組結(jié)構(gòu)，往往會(huì)顯著過(guò)度表達(dá)修復(fù)的蛋白質(zhì)，從而改變蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的化學(xué)計(jì)量，并可能導(dǎo)致潛在的假陽(yáng)性“修復(fù)”結(jié)果。而缺乏適當(dāng)?shù)幕蛘{(diào)控，可以通過(guò)使用小基因或細(xì)菌人工染色體得以解決，這些方法對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種人造情況。

      為了彌補(bǔ)這一差距，該研究小組開(kāi)發(fā)出一種高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重組方法，通過(guò)將表型突變加上選擇性siRNA位點(diǎn)同時(shí)引入一個(gè)基因的一個(gè)等位基因中，來(lái)研究哺乳動(dòng)物的基因功能，可允許在同一細(xì)胞中野生型和突變型蛋白的表達(dá)。

      通過(guò)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒和篩選siRNA序列，研究人員可容易地識(shí)別沉默的點(diǎn)突變，以產(chǎn)生siSN序列。rAAV和等位基因特異性siRNA相結(jié)合，可讓我們選擇性地研究相同遺傳學(xué)背景中內(nèi)源條件下表達(dá)和調(diào)控的單倍不足（siSN）和突變體（siWT）。更重要的是，最近一項(xiàng)單細(xì)胞RNA-seq研究確定，76%到88%的人類(lèi)常染色體基因是雙等位基因，只有12%到24%的是單等位基因。這表明，該研究小組開(kāi)發(fā)的CRISPR–Cas9和 rAAV方法，應(yīng)該能夠適用于人類(lèi)基因組中絕大部分的基因。

      總的來(lái)說(shuō)，這種CRISPR加rAAV方法，對(duì)于研究?jī)?nèi)源基因功能具有廣泛的適用性，大大克服了經(jīng)典基因修復(fù)方法的相關(guān)問(wèn)題。

(來(lái)源：生物通)