在一項新研究中，麻省理工學院的研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對受到感染的哺乳動物肝細胞進行基因組編輯，從中刪除了乙肝病毒（HBV）DNA。根據(jù)發(fā)表在《Scientific Reports》雜志上的研究結果，該研究小組靶向切割了HBV病毒共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的一些特異位點。

      根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，全球有20多億人曾受到過乙型肝炎病毒感染，大約3.5億至4億人罹患慢性HBV感染，在亞洲和非洲發(fā)病率尤其高。他們面臨著形成肝硬化或甚至肝癌的高風險。盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物可以控制乙型肝炎病毒，但卻不能完全清除它。因此，一旦停止治療患者肝臟中的HBV會重新活化。這是因為cccDNA “匿藏”在細胞核中。

      HBV的基因組（rcDNA）進入到細胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主細胞因子的幫助下修復成cccDNA。前基因組RNA（pgRNA）出核后，在胞質中形成εpgRNA，并與病毒的聚合酶P蛋白共價結合，誘發(fā)核衣殼化。與多數(shù)其他的病毒DNA的機制不同，HBV cccDNA通過pgRNA的反轉錄進行復制，而cccDNA主要以微小染色體的形式存在于肝細胞內，且其半衰期很長（33～100天），細胞核內的最長壽命可達14年。

      只要還存在于肝細胞中，cccDNA乙肝病毒的復制就不會停止，并與病毒蛋白裝配成新的完整HBV，以芽生的方式再感染健康的肝細胞，而這是導致乙肝復發(fā)的根本原因。因此，盡管每個肝細胞內只有約5～50個cccDNA拷貝，但是只要這些cccDNA池穩(wěn)定，就可以使得病毒的持續(xù)感染延續(xù)，因而清除肝細胞內的cccDNA是乙肝徹底治愈所必需的。

      CRISPR （clustered regularly interspersed short palindromic repeats）/Cas是源于細菌及古細菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，它可利用靶位點特異性的RNA指導Cas蛋白對靶位點序列進行修飾。其中的一個關鍵因子就是Cas酶，能用于切斷靶標DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一個就是稱為導向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過互補結合靶標。隨著以CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯技術靶標特異性不斷得到提高，其在血液病、腫瘤、傳染病和其他遺傳疾病等一系列與人類健康和疾病相關的基因治療的應用領域展現(xiàn)出極大的應用前景。

      論文的主要作者之一Vyas Ramanan說：“我們?yōu)槲磥砝肅RISPR/Cas9來靶向慢性HBV感染提供了強有力的理論依據(jù)。”

      Ramanan和同事們設計了24條單鏈向導RNAs （sgRNAs）來靶向從在線病毒序列信息資源庫中鑒別出的一些HBV基因組位點。經過初篩測試后，研究小組將三個最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然后將它們轉導到了整合HBV的人類肝細胞內。

      Ramanan說：“對包含整合基因組病毒DNA的穩(wěn)定轉染細胞系展開實驗，我們看到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時cccDNA下降了92%。”研究小組還觀察到病毒基因表達和復制均顯著減少。“進一步地在從頭感染模型中我們開展研究，在第9天我們看到這些病毒參數(shù)同樣大幅度降低。”

      現(xiàn)在，Ramanan計劃在人類肝嵌合小鼠模型中測試這一方法，以評估和優(yōu)化傳遞方法和給藥方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到達人類功能性的治愈。

      “盡管還有很多的工作要做，但我認為這是一個有趣的開始，”Ramanan說。

(來源：生物通)