【中國化工儀器網(wǎng) 國際新聞】來自清華大學(xué)、中科院微生物研究所的研究人員報(bào)告稱，他們開發(fā)出了一種新技術(shù)，通過Cas9輔助靶向染色體片段（CATCH），可一步靶向克隆出大基因簇（延伸閱讀：華人學(xué)者技術(shù)突破：將CRISPR應(yīng)用于分子克隆）。這一重要的研究成果發(fā)布在9月1日的《自然通訊》（Nature Communications）雜志上。

        清華大學(xué)的朱聽（Ting Zhu）研究員、特拉維夫大學(xué)的Yuval Ebenstein，以及中科院微生物研究所的婁春波（Chunbo Lou）研究員是這篇論文的共同通訊作者。

        在工程改造生物體以生成高附加價(jià)值的生物分子，諸如藥物制劑和生物燃料的相關(guān)研究工作中，克隆大基因簇的長基因組片段是其中一個重要的步驟。傳統(tǒng)基于PCR的克隆方法往往受到序列長度和DNA模板GC含量的限制：標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)常規(guī)可生成長度為10kb的片段，而獲得更長的PCR產(chǎn)物則需要繁瑣地去優(yōu)化反應(yīng)條件，即便在理想的條件下通常也限制在35 kb?；蛘?，可以通過組裝多個短片段，如重疊PCR產(chǎn)物或化學(xué)合成的DNA寡核苷酸來生成感興趣的長基因組序列，但這樣的方法往往費(fèi)時且昂貴，尤其是想要獲得長度大約50 kb的序列時（這通常需要3-5個階段，每個階段包含多個組裝事件）。

        另一個獲得長基因組序列的途徑就是采用限制性酶來消化基因組DNA。然而，作為一種非靶向性方法，從大量的限制性消化產(chǎn)物中挑出特異的目的序列非常具有挑戰(zhàn)且麻煩。某些技術(shù)如轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的重組克隆方法（TAR）和單鏈逐次退火，已被用于在限制性酶消化后來特異性克隆長細(xì)菌基因簇。但這些技術(shù)的應(yīng)用仍然受到限制，因?yàn)樗鼈円蕾囉谠诎谢蚪M區(qū)域兩邊獲得獨(dú)特的限制位點(diǎn)，并且在靶序列中存在選擇標(biāo)記物。為了推動生物技術(shù)和合成生物學(xué)進(jìn)步，開發(fā)出一種通用方法來克隆常規(guī)方法難于獲得的幾乎任意的長基因組序列至關(guān)重要。

        向?qū)NAs可以引導(dǎo)CRISPR-Cas9核酸酶來切割靶DNA的特異序列。就釀膿鏈球菌（spCas9）來說，向?qū)NA系統(tǒng)由CRISPR RNA （crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）構(gòu)成——二者可融合形成單鏈向?qū)蛄校╯ingle guide RNA， sgRNA）。靶向序列包含與crRNA互補(bǔ)的前間隔序列（protospacer）和.前間隔序列鄰近基序（PAMs）。相比于傳統(tǒng)的限制性酶有著限制為4–8 bp的固定識別位點(diǎn)，使用長的（~20 bp）、可編程的前間隔序列來作為識別位點(diǎn)，可為spCas9核酸酶系統(tǒng)提供高度的靶向特異性和通用性。這已推動廣泛開發(fā)出了用于基因組編輯、序列特異性控制基因表達(dá)、體內(nèi)成像的基于Cas9的工具。相比之下，尚未充分探索Cas9系統(tǒng)的體外潛在應(yīng)用；研究人員主要將焦點(diǎn)放在了測試Cas9的切割效率和序列識別特異性上。

        在這篇文章中研究人員證實(shí)spCas9除了是一種通用的基因組編輯工具，體外應(yīng)用spCas9可以前所未有的效率和簡易性克隆大基因簇。他們描述了一種技術(shù)，其能夠一步靶向克隆幾乎任意的、長達(dá)100kb的長細(xì)菌基因組序列。在體外借助于RNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶在兩個指定位點(diǎn)從細(xì)菌染色體中切下目標(biāo)基因組片段，然后通過Gibson組裝將其連接到克隆載體中。這一技術(shù)可成為目標(biāo)克隆大基因簇一種有效的分子工具。

      

(來源：生物通)