來自東京大學(xué)、麻省理工學(xué)院與哈佛大學(xué)Broad研究所的研究人員，在新研究中揭示出了新兇手弗朗西絲菌Cas9(FnCas9)的結(jié)構(gòu)，并利用這一結(jié)構(gòu)信息對FnCas9進(jìn)行改造構(gòu)建出了一個變異體。研究成果發(fā)布在2月25日的《細(xì)胞》（Cell）雜志上。

京東大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系Osamu Nureki教授，及Nureki實(shí)驗室生物物理學(xué)和生物化學(xué)助理教授Hiroshi Nishimasu是這篇論文的共同通訊作者。Broad研究所核心成員張鋒（FengZhang）博士是這篇論文的合著作者。2014年2月，張鋒曾與Nureki教授聯(lián)手合作生成了CRISPR/Cas系統(tǒng)關(guān)鍵組成部分——Cas9復(fù)合體的第一張高分辨率圖像。這一重要的研究成果發(fā)布在Cell雜志上。

來自CRISPR- Cas系統(tǒng)的RNA引導(dǎo)DNA核酸內(nèi)切酶Cas9，可以結(jié)合雙RNA導(dǎo)向序列crRNA （CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating RNA)，或合成的單導(dǎo)向RNA(sgRNA)，切割與導(dǎo)向RNA互補(bǔ)的雙鏈靶DNA。當(dāng)前有幾種Cas9直系同源物，例如化膿性鏈球菌Cas9 (SpCas9)和金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)已被利用于真核生物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因組編輯。科學(xué)家們還在致力不斷地改進(jìn)這些技術(shù)。

在發(fā)表于2015年11月Nature Biotechnology雜志上的一篇研究論文中，研究小組報告稱演化出了SaCas9的一種變體，它能夠識別更廣泛的核苷酸序列，靶向以往CRISPR-Cas9技術(shù)無法觸及的基因組位點(diǎn)。

2015年12月，張鋒領(lǐng)導(dǎo)麻省理工學(xué)院-哈佛醫(yī)學(xué)院Broad研究所和麻省理工學(xué)院McGovern腦研究所的研究人員，設(shè)計改造了革命性的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，大大減少了“脫靶”編輯錯誤。這一完善的技術(shù)解決了使用基因組編輯時面對的一個主要技術(shù)問題。研究論文發(fā)表在Science雜志上。

除了要求RNA-DNA互補(bǔ)配對，Cas9識別和切割DNA還需要在靶DNA序列的鄰近下游存在“PAM”（ protospacer adjacent motif）的短DNA序列，由此限制了Cas9介導(dǎo)基因組編輯可靶向序列的范圍。來自不同微生物的Cas9直系同源物識別不同的PAM序列，SpCas9和SaCas9分別識別5′-NGG-3′和5′-NNGRRT-3′ PAMs。

Cas9直系同源物的長度和序列具有高度的差異，氨基酸殘基的數(shù)量在大約900-1600之間，F(xiàn)nCas9是最大的成員之一。FnCas9包含1,629個氨基酸，相比于其他的Cas9直系同源物如SpCas9 (1,368個氨基酸)和SaCas9 (1,053個氨基酸)要大得多。值得注意地是，以往的一項研究報道FnCas9不僅可以介導(dǎo)crRNA:tracrRNA依賴性DNA切割，還可介導(dǎo)scaRNA（小CRISPR/Cas相關(guān)RNA）:tracrRNA依賴的基因表達(dá)調(diào)控。但目前對于FnCas9執(zhí)行其雙重功能的機(jī)制仍不清楚。此外，也尚未探索FnCas9在基因組編輯應(yīng)用中的潛力。

在這篇Cell新文章中研究人員報告稱，獲得了FnCas9–sgRNA–靶DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到1.7埃（Å）。通過比較FnCas9和其他Cas9直系同源物SpCas9 與SaCas9，揭示出了親緣關(guān)系遙遠(yuǎn)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)之間的保守特征及驚人的結(jié)構(gòu)差異。他們發(fā)現(xiàn)FnCas9識別的是5′-NGG-3′ PAM，并利用這一結(jié)構(gòu)信息構(gòu)建出了一個識別5′-YG-3′ PAM的Cas9異構(gòu)體。此外，研究人員證實(shí)可以將預(yù)組裝的FnCas9–sgRNA核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物通過顯微注射到小鼠受精卵中編輯具有5′-YG-3′ PAM的內(nèi)源性位點(diǎn)，由此擴(kuò)大了CRISPR-Cas9工具箱的靶向空間。

參考文獻(xiàn)：Structure and Engineering of Francisella novicida Cas9